慢病毒感染细胞实验原理与流程(二)

作者：三青时间：2023-06-17 阅读数：人阅读

在慢病毒感染细胞实验原理与实用流程(一)中，我们学习了利用目的基因包装成慢病毒感染细胞的原理，今天就和医学方小编学习具体如何操作。

质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（病毒包装）

293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。

小编将以293T细胞包装慢病毒，感染10cm SW480结肠癌细胞为例：

DAY1

转染前一天，用1ml胰酶消化293T细胞1-2分钟，用含10% FBS的 DMEM培养基重悬293T细胞，铺2-3*106个细胞至 10cm dish中(70-80% 融合度)；(注：慢病毒包装时要多种一点儿293T细胞，慢病毒对细胞的毒性较大！)

DAY2

（转染时准备无双抗完全培养基，抗生素对转染中细胞损伤大）

1、转染293T细胞(10cm dish)：

A：用470ul optimem稀释30ul Fugene 9（其他转染试剂比例详见其说明书）, 并充分轻轻地混匀，室温下静置5 min

B：准备 target plasmid 和包装载体plasmid：

pCMV8.9/ psPAX2：3.33ug （注：10cm dish 的量）

PMD.G / pMD2.G：1.67ug （注：10cm dish的量）

Target plasmid ： 5ug（注：这3个质粒都加在同一个EP管中）

六孔板的量是：

pCMV8.9/ psPAX2： 1ug

PMD.G / pMD2.G： 0.5ug

Target plasmid： 1ug

C：将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene 9的混合液中，RT ,静置20min；

2、6-8h后对293T细胞换液，注意加液时，不要吹起细胞（沿着皿壁，轻轻地加新培液）；置37°细胞培养箱中继续培养48h；-----随后同时做SW480细胞的铺板（见后）。

DAY3

SW480细胞的铺板：目的细胞SW480，需要提前一天铺板至10cm dish中（10cm dish SW480细胞接种个数是1*106个，六孔板大约2—3*105个），以保证感染时的密度为30~40%；同时准备一个对照组10cm dish细胞，不感染病毒（注：SW480细胞比较难消化，贴壁比较牢，得放在培养箱中消化4min）。第二天弃上清液。

DAY4

慢病毒液的收集：转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min，将上清液用0.45um滤头过滤。再向10cm dish加10ml培液，24h之后，可以再次收集上清液，按照每次用量分装，保存于-80°冰箱中。(如果病毒液暂时不用，可以置-80°冰箱中避光保存，千万不能反复冻融)。可以选择用浓缩管浓缩。

慢病毒感染目的细胞SW480：

1、配置3ml 培养基1640 (10%FBS), 然后加入3ml 病毒上清液(剩余的病毒上清液放-80冰箱中保存), 24h之后补加4ml 1640培养液，为了保证细胞处于良好状态；

2、10cm dish置于细胞培养箱中再培养24h；-------（如果目的基因带有GFP标签，72h之后可以通过荧光显微镜看感染情况）；

3、48h后，弃上清，更换新鲜培养基6~8ml，并加入相应浓度药物筛选（G418或者嘌呤霉素）；

4、筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，不感染病毒的对照组细胞应该全部死光，而感染病毒的细胞存活率较高；也可通过观察GFP的亮度,判断筛选是否成功，随后用流式细胞仪进行分选。

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