慢病毒感染细胞常见问题分析

 

1.用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？

根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右，则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右；

针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～60%，但要确保在感染后4天时细胞汇合度达到90%～100%；

针对非分裂细胞： 如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

2.如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间？

慢病毒感染细胞后需要4天的时间才能观察到慢病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度20~40%时且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后4天时细胞增长达到90% ～100%的汇合度。

3.加入慢病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？

这种情况是由于慢病毒对该细胞有一定的毒性作用，需要调整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小时、8小时、12小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

4.慢病毒感染后细胞中出现大量黑点？

在排除细菌及真菌污染后，细胞中的黑点通常为细胞碎片。在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个原因：a、慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；b、支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。但支原体

5.慢病毒感染细胞后什么时候基因表达到达峰值？

慢病毒感染后大部分细胞4天左右GFP或目的基因表达达到峰值，但是对于生长缓慢的细胞，达到峰值的时间会更长。

6.细胞能被慢病毒感染，但为何GFP荧光很弱？

GFP慢病毒感染细胞后，细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因前面的启动子活性等因素。

通常目的细胞感染慢病毒颗粒数越多，细胞本身增殖越快，GFP荧光会较强。慢病毒在增殖较快的细胞中感染96~120小时后，GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中感染后，GFP蛋白表达达到峰值需要更长的时间。GFP基因接在强启动子后面时荧光表达强；GFP接在弱启动子后面时荧光表达较弱。

7.如何提高慢病毒对细胞的感染效率？

慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响，如细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如将细胞培养板密封后，用平角转子离心机1000g离心1h，再放回培养箱中正常培养。