宋博锴、盛心磊等揭示病毒感染对细胞微环境的重塑和调控

 

在多细胞生物中，细胞间的通讯和信息传递在正常生命活动、应激、和疾病发生中起到不可或缺的作用。在病毒感染中，被感染细胞和周围组织细胞的通讯也是病毒传播的重要因素。从宿主角度，病毒感染引起宿主细胞的免疫反应。从病毒的方面，以疱疹病毒科为例，其感染诱导的外泌体中发现了病毒蛋白质和mRNA【1，2】，这可能代表了病毒感染影响微环境的机制。传统上，研究病毒感染主要是通过对感染的细胞和未感染细胞进行比较，并没有策略可以提供空间上的解析度，来探究病毒感染对微环境中与靠近或远离被感染位点的未感染细胞所带来的影响。

2023年5月10日，美国普林斯顿大学Ileana Cristea教授团队在Science Advances杂志在线发表了题为Inter-cellular communication within the virus microenvironment impacts the susceptibility of cells to secondary viral infections的研究论文，揭示了病毒感染通过细胞间信息传递影响局部微环境从而促进病毒向邻近细胞传播。该研究建立了基于细胞培养的病毒微环境模型，以及感染细胞、邻近细胞、远端细胞的分选方法，并首次揭示了这些细胞群体的蛋白质组学差异。人类巨细胞病毒（HCMV）感染，会使邻近细胞表现出被抑制的天然免疫反应以及细胞周期失调。相较于远端细胞，邻近细胞对HCMV、1型单纯疱疹病毒（HSV-1）和甲型流感病毒（IAV）的易感性有所增加。这项工作为研究病毒感染对周围微环境的重塑，以及研究病毒微环境内细胞通讯的时空复杂性奠定了基础。

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首先，为了辨别并分选病毒微环境中不同细胞群体，研究人员借鉴并优化了前人利用细胞穿透性荧光蛋白对肿瘤微环境niche的标记策略【3】。通过表达带有信号肽（SP）和脂质穿透性肽段（TATk）的mCherry荧光蛋白，细胞可以在共培养中标记邻近细胞。研究人员构建了表达SP-TAT-mCherry的人源成纤维细胞（MRC5），并用带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的HCMV进行感染，一小时后，再将被感染细胞与野生型（WT）MRC5细胞共培养48小时，以建立病毒微环境。在此系统中，被感染细胞带有红绿两种荧光标记，邻近细胞带有红色荧光，而远端细胞没有荧光标记，研究人员从而可以利用流式细胞荧光分选技术（FACS）辨别并分离这三种细胞群体，从而进行定量蛋白质组学分析。同时，研究人员单独分选了未感染的野生型细胞作为阴性对照。为了证明细胞群体分选的有效性，研究人员通过实时荧光定量PCR（qPCR）对病毒DNA进行量化分析。与感染细胞相比，邻近细胞和远端细胞中的病毒DNA显著较少，表明FACS有效地富集了不同的细胞亚群。值得一提的是，HCMV复制周期较长，感染后48小时病毒颗粒尚未释放，确保了邻近细胞和远端细胞仍处于未感染状态。

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图1 构建病毒微环境并分选病毒微环境中的感染细胞，邻近细胞，和远端细胞

在蛋白质组学分析中，研究人员首先观察到HCMV病毒蛋白质的总体丰度具有感染>邻近>远端的趋势。从病毒结构上看，邻近细胞中检测到更多的被膜和非结构蛋白和较少的衣壳和囊膜蛋白；从表达时间上看，邻近细胞中检测到更多的早期蛋白而非晚期蛋白。这表明邻近细胞中的病毒蛋白质可能来自于感染细胞的分泌，而不是裂解性感染。利用细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）抑制剂，研究人员证实了病毒蛋白的释放与传递部分通过外泌体完成。这些病毒蛋白表明病毒可能具有促进相邻细胞感染进程的机制。

接下来研究人员着重分析了不同细胞群体中宿主蛋白的丰度差异。最引人注目的是，在远端细胞，而非邻近细胞中，干扰素刺激基因（ISG）等抗病毒蛋白的表达量更高。在感染过程中，模式识别受体（pattern recognition receptor）感知病原体并诱导干扰素和其他细胞因子的表达，通过旁分泌信号转导，使周围的细胞表达ISG。但本研究表明，尽管邻近细胞更早地暴露于早期感染时释放的细胞因子，但却比远端细胞群体的天然免疫反应弱。这可能是因为被感染细胞可以通过EV传递病毒RNA和蛋白质（例如pUL37，pUL83等）在附近的细胞中抑制免疫反应。类似地，研究人员在邻近细胞中还发现了其他促病毒的蛋白质组学变化。相较于远端细胞，邻近细胞中与细胞外基质（ECM）相关的蛋白质水平降低，代表病毒可能通过削减邻近细胞的物理屏障来促进病毒扩散。此外，一些促病毒的膜接触位点 (membrane contact site，MCS) 蛋白【4】在邻近细胞中的蛋白水平也有所升高。总的来说，这些蛋白质的丰度差异代表邻近细胞中出现了促进病毒扩散的改变。

另外，研究人员注意到，部分细胞周期相关的蛋白水平在不同细胞群体中有显著升高。为了探究邻近细胞是否出现细胞周期失调，研究人员使用基于点击化学和流式细胞术的方法对病毒微环境中细胞群体的细胞周期状态进行分析。他们发现，邻近细胞与远端细胞相比有较多处于早期S期和M期，与相关蛋白水平的变化结果一致。值得注意的是，邻近细胞与远端细胞的G2期细胞比例没有变化，这很可能表明邻近群体M期细胞的增加不是由于G2/M检查点失活，而是由于有丝分裂的进程受到了损害，这也与邻近细胞中APC/C复合物组分蛋白水平的下降相一致。考虑到邻近细胞中部分病毒蛋白（例如pUL82和pUL97导致细胞周期加速）的水平升高，邻近细胞表现出的细胞周期加速和M期阻滞，可能代表了病毒感染对邻近细胞的操纵。

通过以上发现，研究人员做出了邻近细胞比远端细胞更易受到感染的假设。这个假设在基于免疫荧光成像（IF imaging）的二次感染实验中得到了验证。通过对HCMV病毒微环境系统受到二次感染后的免疫荧光图像加以定量分析，研究人员发现邻近细胞被HCMV二次感染的比例更高。为了探究HCMV的初次感染是特异性地使邻近细胞对HCMV易感性升高，还是对其他病毒的次生感染也有影响，研究人员用上述模型测试了1型单纯疱疹病毒（HSV-1）和甲型流感病毒（IAV）的二次感染。结果表明，邻近初次HCMV感染的细胞对HSV-1和IAV也更易感。综上所述，病毒感染通过细胞间通信重塑了局部微环境，从而促进病毒向邻近细胞传播。

这项工作开创性地探索了病毒微环境领域，为之后的研究提供了丰富的数据资源和重要参考。

普林斯顿大学的宋博锴博士和盛心磊博士为本文的共同第一作者，Ileana Cristea教授为本文的通讯作者。

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adg3433?af=R

制版人：十一

参考文献

1. S. Zicari, A. Arakelyan, R. A. N. Palomino, W. Fitzgerald, C. Vanpouille, A. Lebedeva, A. Schmitt, M. Bomsel, W. Britt, L. Margolis, Human cytomegalovirus-infected cells release extracellular vesicles that carry viral surface proteins. Virology 524, 97-105 (2018).

2. M. Kalamvoki, T. Du, B. Roizman, Cells infected with herpes simplex virus 1 export to uninfected cells exosomes containing STING, viral mRNAs, and microRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 111, E4991-4996 (2014).

3. L. Ombrato, E. Nolan, I. Kurelac, A. Mavousian, V. L. Bridgeman, I. Heinze, P. Chakravarty, S. Horswell, E. Gonzalez-Gualda, G. Matacchione, A. Weston, J. Kirkpatrick, E. Husain, V. Speirs, L. Collinson, A. Ori, J. H. Lee, I. Malanchi, Metastatic-niche labelling reveals parenchymal cells with stem features. Nature 572, 603-608 (2019).

4. K. C. Cook, E. Tsopurashvili, J. M. Needham, S. R. Thompson, I. M. Cristea, Restructured membrane contacts rewire organelles for human cytomegalovirus infection. Nature communications 13, 4720 (2022).